天木生物ARTP與MMC成功助力靈芝菌株的高通量選育

本期為您推薦上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院張勁松研究員團(tuán)隊(duì)近期公開的一份發(fā)明zl：一種靈芝菌株的高通量選育方法。該研究利用室溫常壓等離子體誘變儀（ARTP），構(gòu)建大規(guī)模誘變庫，結(jié)合微液滴培養(yǎng)技術(shù)（MMC）進(jìn)行高通量篩選，篩選到三個(gè)靈芝菌株，通過搖瓶傳代5次發(fā)現(xiàn)三個(gè)靈芝誘變株的遺傳性狀穩(wěn)定，可應(yīng)用于靈芝產(chǎn)業(yè)中的生產(chǎn)和研究。

靈芝(Ganoderma lucidum)是一種重要的藥用真菌，具有多種藥用功效，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等。近年來，隨著人們對(duì)健康食品和保健品的需求增加，靈芝及其相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)需求也日益增長(zhǎng)。然而，靈芝的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量較低，限制了其應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。目前，常見的靈芝菌株選育方法主要是利用化學(xué)誘變法和物理誘變法?；瘜W(xué)誘變法會(huì)帶來較高的毒性和突變率，可能存在味道不好和生物安全問題。而物理誘變法在保證品質(zhì)穩(wěn)定和生物安全的同時(shí)，也能產(chǎn)生大量變異體。

近年來，ARTP誘變技術(shù)在在生物育種中有著廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)具有誘變效率高、操作簡(jiǎn)便、突變范圍廣、不影響基因組整體穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。MMC技術(shù)則是一種高通量微量培養(yǎng)技術(shù)，通過使用微小培養(yǎng)箱和液面控制器，將大量菌株同時(shí)在微小體積內(nèi)培養(yǎng)，從而減小了單個(gè)菌株生長(zhǎng)過程中的擾動(dòng)，并可同時(shí)研究多個(gè)菌株在不同環(huán)境下的代謝活性。結(jié)合使用ARTP和MMC技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物菌株的快速、高效的選育，從而提高菌株的產(chǎn)量、適應(yīng)性和其他優(yōu)良性狀，為靈芝的高通量篩選提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)靈芝菌株G0023活化并制備原生質(zhì)體，利用ARTP IIS對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，計(jì)算致死率（圖1）。當(dāng)致死率達(dá)到90％的時(shí)候所設(shè)置的參數(shù)作為后期處理的最佳處理參數(shù)。針對(duì)誘變后的原生質(zhì)體，利用MMC系統(tǒng)(微生物液滴培養(yǎng)儀)進(jìn)一步篩選，選育靈芝G0023誘變菌株。對(duì)野生菌株與誘變篩選后的菌株進(jìn)行平板與搖瓶水平進(jìn)行比較，分析其生長(zhǎng)性能，葡萄糖的利用與三萜的產(chǎn)量，并對(duì)誘變菌株進(jìn)行傳代，驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性。

利用平板的菌落半徑從誘變庫中篩選出3株菌株（表1），搖瓶中發(fā)酵并測(cè)定誘變菌株對(duì)底物葡萄糖利用率，菌絲體干重，菌絲體中三萜產(chǎn)量。結(jié)果顯示4個(gè)菌株在發(fā)酵7天后，培養(yǎng)基中葡萄糖的利用率都處于較高水平（圖2），其中2株菌的菌絲干重較野生型提高26.33％和17.85％。這兩株菌的三萜產(chǎn)量提高了32.10％和15.72％（圖3）。三個(gè)菌株搖瓶傳代5次后對(duì)其生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各誘變株遺傳穩(wěn)定性較好（圖4）。這些結(jié)果顯示用ARTP誘變技術(shù)和MMC高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，可以從靈芝菌株中高效篩選出生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)物含量豐富的優(yōu)良菌株。

圖1 靈芝G0023原生質(zhì)體致死率曲線

表1 三個(gè)誘變菌株與G0023在平板生長(zhǎng)速度

圖2 G0023與誘變菌株搖瓶發(fā)酵情況

圖3 G0023與誘變菌株菌絲體總?cè)飘a(chǎn)量

圖4 三個(gè)誘變菌株遺傳穩(wěn)定性分析